正版新书]基孔肯雅病毒理论与实验技术指南(新加坡)J.朱江昂等

目录
第一部分  临床和诊断病毒学
第一章  基孔肯雅病毒进化和流行病学  3
1.1  引言  3
1.2  病毒的传播循环和媒介  3
1.3  病毒的历史和起源  4
1.4  2004年以来基孔肯雅病毒的流行病学和感染传播情况  5
1.5  基孔肯雅病毒在西半球的感染情况  6
1.6  结语  7
参考文献  7
第二章  基孔肯雅病毒分子流行病学  10
2.1  引言  10
2.2  材料  12
2.2.1  病毒RNA的提取  12
2.2.2  一步法反转录-聚合酶链反应（One-step RT-PCR）  12
2.2.3  聚合酶链反应（PCR）产物的琼脂糖凝胶电泳和纯化  13
2.2.4  测序反应  13
2.2.5  PCR测序产物的纯化  13
2.3 方法  14
2.3.1  病毒RNA的提取  14
2.3.2  一步法RT-PCR  14
2.3.3  琼脂糖凝胶电泳和纯化PCR产物  14
2.3.4  测序反应  15
2.3.5  纯化循环测序产物  15
2.3.6  测序数据编辑  16
2.3.7  系统发育树的构建  16
2.4  注释  16
参考文献  17
第三章  高级遗传方法学在基孔肯雅病毒进化和传播追踪溯源研究中的应用  19
3.1  引言  19
3.2  材料  20
3.3  方法  20
3.3.1  序列生成  21
3.3.2  从公共数据库获得序列  21
3.3.3  多序列比对  21
3.3.4  序列多态性和基因突变分析  22
3.3.5  中值连接进化网络的构建  23
3.3.6  生成一个时间尺度的贝叶斯系统发育树，并通过BEAST软件包计算目标序列到最近的共同祖先的时间（tMRCA）以确定祖先的年代  24
3.3.7  BEAST跟踪输出的可视化  26
3.3.8  用BEAST系统发育树输出方式构建优选分支可信度树  27
3.3.9  一致优选分支可信度树的可视化  27
3.3.10  通过BEAST2软件进行系统地理学分析来确定病毒株时空传播特点  27
3.3.11  用SPREAD软件使系统地理学输出可视化  29
3.4  注释  29
参考文献  32
第四章  基于合成肽的抗体检测方法诊断有无神经系统并发症的基孔肯雅病毒感染  34
4.1  引言  34
4.2  材料  35
4.2.1  单向电泳  35
4.2.2  双向电泳  36
4.2.3  电洗脱  37
4.2.4  液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析  37
4.2.5  多肽合成  37
4.2.6  酶联免疫吸附试验（ELISA）  38
4.3  方法  38
4.3.1  单向电泳  38
4.3.2  双向电泳  39
4.3.3  电洗脱  41
4.3.4  蛋白液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析  41
4.3.5  多肽合成41
4.3.6  酶联免疫吸附试验（ELISA）  42
4.4  注释  43
参考文献  44
第五章  E2糖蛋白在Sf9昆虫细胞的表达和纯化及其在血清学中的应用  45
5.1  引言  45
5.2  材料  46
5.2.1  昆虫表达组件的构建  47
5.2.2  Sf9细胞的维持及E2糖蛋白的瞬时表达  47
5.2.3  在昆虫细胞中稳定表达E2糖蛋白  47
5.2.4  稳定表达细胞的冻存  48
5.2.5  自然分泌CHIKV-E2的纯化  48
5.2.6  基孔肯雅病毒的血清学诊断  48
5.3  方法  48
5.3.1  构建昆虫表达组件  48
5.3.2  Sf9细胞的维持和E2糖蛋白的瞬时表达  49
5.3.3  E2糖蛋白在昆虫细胞中的稳定表达  50
5.3.4  稳定细胞的低温保存  51
5.3.5  纯化自然分泌的CHIKV-E2蛋白  51
5.3.6  CHIKV的血清学诊断  52
5.4  注释  53
参考文献  54
第六章  基于血清学工具的CHIKV感染诊断方法  55
6.1  引言  55
6.2  材料  60
6.3  方法  61
6.3.1  血清样品的准备  61
6.3.2  血清和病毒混合液的准备  62
6.3.3  细胞培养  62
6.3.4  用中和过的病毒感染细胞  62
6.3.5  计算结果  62
6.4  注释  62
参考文献  63
第七章  使用咽拭子及尿液标本诊断基孔肯雅病毒感染及其评价  65
7.1  引言  65
7.2  材料  66
7.2.1  病毒检测  66
7.2.2  ELISA检测IgM抗体  66
7.2.3  体外病毒分离  67
7.2.4  体内病毒分离  67
7.3  方法  67
7.3.1  通过分子生物学技术和测序分析检测病毒基因组  67
7.3.2  IgM抗体捕获-ELISA血清学检测  68
7.3.3  体外病毒分离  69
7.3.4  体内病毒分离  70
7.4  注释  70
参考文献  71
第二部分  细胞培养、病毒复制和细胞反应
第八章  用蚊子细胞扩增基孔肯雅病毒  75
8.1  引言  75
8.2  材料  76
8.2.1  培养C6/36细胞  76
8.2.2  病毒扩增  76
8.3  方法  76
8.3.1  培养C6/36细胞  76
8.3.2  病毒扩增  77
8.4  注释  78
参考文献  79
第九章  基孔肯雅病毒感染的定量分析——病毒蚀斑试验  81
9.1  引言  81
9.2  材料  82
9.3  方法  83
9.3.1  收集用于蚀斑试验的样本  83
9.3.2  接种BHK-21细胞于24孔板  84
9.3.3  蚀斑试验  84
9.4  注释  86
参考文献  88
第十章  实时RT-PCR检测与定量分析基孔肯雅病毒  90
10.1  引言  90
10.2  材料  91
10.2.1  寡核苷酸序列  91
10.2.2  病毒RNA提取  91
10.2.3  常规RT-PCR  91
10.2.4  PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及纯化  92
10.2.5  体外转录合成cDNA  92
10.2.6  一步法SYBR Green I实时RT-PCR  92
10.2.7  一步法TaqMan实时RT-PCR  92
10.3  方法  92
10.3.1  病毒RNA提取  93
10.3.2  体外转录PCR产物的制备  93
10.3.3  琼脂糖凝胶电泳及PCR产物纯化  93
10.3.4  体外转录  94
10.3.5  RNA转录物的纯化  94
10.3.6  总RNA产量的计算  94
10.3.7  体外转录RNA拷贝数测定  95
10.3.8  用于RNA绝对定量的标准品构建  95
10.3.9  基于SYBR-Green I的实时RT-PCR的绝对定量  95
10.3.10  基于TaqMan的实时RT-PCR的绝对定量  97
10.3.11  定量未知样本中CHIKV载量  97
10.4  注释  98
参考文献  100
第十一章  伊蚊的基孔肯雅病毒感染  102
11.1  引言  102
11.2  材料  103
11.2.1  含CHIKV的血液（CHIKV血饲）  103
11.2.2  蚊子感染  103
11.2.3  从蚊子收集CHIKV  104
11.2.4  处理采集的蚊子脏器  104
11.3  方法  104
11.3.1  准备含病毒的血食物  104
11.3.2  蚊子感染  105
11.3.3  采集和处理受感染蚊虫的脏器  106
11.3.4  处理采集的蚊虫组织器官  108
11.4  注释  108
参考文献  109
第十二章  人工血食物感染蚊虫中CHIKV的分析  111
12.1  引言  111
12.2  材料  112
12.2.1  蚊子的饲养  112
12.2.2  制备含感染性CHIKV的血食物  113
12.2.3  感染后蚊子的处理  113
12.2.4  核酸的检测与定量  114
12.3  方法  115
12.3.1  埃及伊蚊和白纹伊蚊群落的饲养  115
12.3.2  蚊子感染性血饲流程  116
12.3.3  暴露后蚊子处理：通过分析CPE检测蚊子中的病毒  117
12.3.4  暴露后蚊子处理：强迫唾液分泌  118
12.3.5  CHIKV核酸检测与定量  119
12.4  注释  119
参考文献  121
第十三章  基孔肯雅病毒生长与荧光标记：免疫荧光法检测基孔肯雅病毒  122
13.1  引言  122
13.2  材料  123
13.2.1  病毒生长  123
13.2.2  荧光显微镜  123
13.2.3  使用IFA进行血清学诊断  124
13.2.4  流式细胞术  124
13.3  方法  125
13.3.1  细胞生长  125
13.3.2  荧光显微镜下确定病毒的生长  125
13.3.3  应用IFA进行血清学诊断  126
13.3.4  流式细胞术测定病毒生长  127
13.4  注释  127
参考文献  128
第十四章  用蔗糖密度梯度分离和制备基孔肯雅病毒样本用于透射电镜观察  130
14.1  引言  130
14.2  材料  131
14.2.1  CHIKV的分离与扩增  131
14.2.2  病毒纯化  131
14.2.3  负染色和免疫金标记法  132
14.3  方法  132
14.3.1  分离CHIKV  132
14.3.2  CHIKV滴定  133
14.3.3  大规模扩增CHIKV用于病毒纯化  134
14.3.4  聚乙二醇（PEG沉淀）纯化病毒  134
14.3.5  不连续的蔗糖梯度纯化病毒  135
14.3.6  负染法  136
14.3.7  免疫胶体金标记  136
14.4  注释  137
参考文献  138
第十五章  酵母双杂交筛选法研究病毒-宿主蛋白的相互作用  139
15.1  引言  139
15.2  材料  141
15.2.1  GAL4 Y2H系统中使用的酵母菌株和质粒  141
15.2.2  培养基  141
15.2.3  酵母转化  142
15.2.4  准备酵母蛋白提取物  143
15.2.5  BD病毒融合构建物自激活的检测  144
15.2.6  病毒-宿主相互作用文库的筛选  144
15.2.7  酵母菌落PCR  144
15.2.8  多重库质粒的排除  145
15.2.9  性消化排除重复文库质粒  145
15.2.10  从酵母中分离捕获质粒DNA  145
15.2.11  大肠杆菌细胞中酵母质粒的转化  145
15.2.12  细菌菌落PCR  145
15.2.13  分离大肠杆菌DH5α细胞中的质粒DNA  146
15.3  方法  146
15.3.1  酵母细胞的小量转化  146
15.3.2  准备酵母蛋白提取物  146
15.3.3  自激活分析  148
15.3.4  酵母双杂交文库筛选  148
15.3.5  酵母菌落PCR  149
15.3.6  消除多重库质粒  150
15.3.7  性酶切消除重复文库质粒  150
15.3.8  从酵母中分离捕获质粒DNA  150
15.3.9  酵母质粒转化大肠杆菌（DH5α）  150
15.3.10  细菌克隆PCR和质粒DNA分离  151
15.3.11  测序分析  151
15.4  注释  151
参考文献  153
第十六章  GelC-MS/MS在基孔肯雅病毒感染蛋白质组分析中的应用：制备用于分析的肽段  155
16.1  引言  155
16.2  材料  156
16.2.1  蛋白制备及定量  156
16.2.2  SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）  157
16.2.3  凝胶染色和脱色（考马斯亮蓝）  158
16.2.4  凝胶染色和脱色（银染）  158
16.2.5  凝胶处理  159
16.2.6  蛋白分析  160
16.3  方法  160
16.3.1  样品制备（在组织培养板或培养瓶中培养的细胞）  160
16.3.2  标本制备（临床材料：白细胞）  161
16.3.3  Lowry法测定蛋白浓度  161
16.3.4  十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）  161
16.3.5  凝胶染色和脱色（考马斯亮蓝）  162
16.3.6  凝胶染色和脱色（银染）  162
16.3.7  还原/烷基化和凝胶内酶切消化  163
16.4  注释  165
参考文献  166
第十七章  生物信息学方法研究基孔肯雅病毒感染过程中病毒与宿主的相互作用  167
17.1  引言  167
17.2  方法  168
17.2.1  病毒蛋白结构  168
17.2.2  鉴定基孔肯雅病毒和宿主的结构相似蛋白  168
17.2.3  CHIKV与宿主蛋白相互作用的预测  168
17.2.4  基因聚类与相互验证  169
17.2.5  结果解释  170
17.3  注释  170
参考文献  170
第十八章  基孔肯雅病毒T细胞表位预测  173
18.1  引言  173
18.2  材料  174
18.2.1  数据  174
18.2.2  软件  174
18.3  方法  174
18.3.1  结合物和非结合物的定义  174
18.3.2  肽序列转化为特征性载体  174
18.3.3  预测模型的建立  175
18.3.4  预测模型的评价  176
18.3.5  CHIKV T细胞表位的预测  177
18.4  注释  178
参考文献  178
第三部分  免疫学和动物模型研究
第十九章  基孔肯雅病毒小鼠模型  183
19.1  引言  183
19.2  材料  184
19.2.1  新生小鼠的脑内感染  184
19.2.2  3周龄到成年小鼠鼻内接种感染CHIKV  184
19.2.3  新生小鼠的皮下接种  185
19.2.4  14天到成年C57BL/6小鼠的足部皮下接种感染  185
19.3  方法  185
19.3.1  新生小鼠的脑内感染  186
19.3.2  CHIKV鼻内感染3周龄到成年小鼠  187
19.3.3  CHIKV皮下接种新生小鼠  188
19.3.4  后肢皮下感染2周龄至成年C57BL/6小鼠  189
19.4  注释  191
参考文献  193
第二十章  使用ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒制备基孔肯雅病毒小鼠特异性单克隆抗体  195
20.1  引言  195
20.2  材料  196
20.2.1  生物材料、细胞培养基和试剂  196
20.2.2  其余设备和物品  196
20.3  方法  197
20.3.1  用基孔肯雅病毒免疫接种小鼠  197
20.3.2  SP2/0骨髓瘤细胞制备  197
20.3.3  小鼠脾细胞制备  197
20.3.4  融合  198
20.3.5  融合细胞接种培养皿  198
20.3.6  挑选克隆  199
20.3.7  克隆和亚克隆筛选  199
20.4  注释  201
参考文献  201
第二十一章  免疫组化检测福尔马林固定和石蜡包埋组织中基孔肯雅病毒抗原  203
21.1  引言  203
21.2  材料  204
21.2.1  石蜡切片  204
21.2.2  免疫组化  204
21.3  方法  204
21.3.1  石蜡切片  204
21.3.2  免疫组化  205
21.4  注释  206
参考文献  207
第四部分  抗病毒药物和疫苗
第二十二章  抗基孔肯雅病毒的抗病毒策略  211
22.1  引言  211
22.2  治疗CHIKV感染的抗病毒策略  212
22.2.1  病毒侵入抑制剂  212
22.2.2  病毒蛋白翻译抑制剂  213
22.2.3  病毒基因组复制抑制剂  214
22.2.4  CHIKV nsP2抑制剂  215
22.2.5  宿主靶点抑制剂  215
22.2.6  未知靶点的抑制剂  217
22.3  结论  218
参考文献  218
第二十三章  实时细胞分析鉴定基孔肯雅病毒的新型抗病毒化合物  222
23.1  引言  222
23.2  材料  223
23.2.1  组织培养  223
23.2.2  细胞  223
23.2.3  病毒  224
23.2.4  抗病毒化合物  224
23.2.5  RTCA组件  224
23.3  方法  224
23.3.1  细胞增殖分析  224
23.3.2  细胞毒性试验  225
23.3.3  抗病毒试验  225
23.4  注释  227
参考文献  228
第二十四章  双顺反子杆状病毒表达载体系统筛选干扰基孔肯雅病毒感染的化合物  229
24.1  引言  229
24.2  材料  230
24.2.1  昆虫细胞培养  230
24.2.2  重组杆状病毒产生与纯化  230
24.2.3  昆虫细胞融合抑制试验  231
24.2.4  化合物体外抗CHIKV活性测定  232
24.3  方法  232
24.3.1  昆虫细胞培养  232
24.3.2  在Sf21细胞中产生重组杆状病毒  232
24.3.3  重组杆状病毒的纯化  233
24.3.4  昆虫细胞融合抑制试验  234
24.3.5  体外抗CHIKV活性测定  235
24.4  注释  236
参考文献  237
第二十五章  基孔肯雅病毒感染中和试验：蚀斑减少中和试验  239
25.1  引言  239
25.2  材料  240
25.3  方法  241
25.3.1  在12孔板准备细胞单层  241
25.3.2  CHIKV-抗体免疫复合物的制备  242
25.3.3  感染检测  242
25.3.4  蚀斑可视化  244
25.3.5  蚀斑减少中和效价的测定  244
25.3.6  微量中和试验  245
25.4  注释  245
参考文献  246
第二十六章  CHIKV反向遗传学研究方法  248
26.1  引言  248
26.2  材料  250
26.2.1  病毒RNA提取  250
26.2.2  反转录  250
26.2.3  PCR扩增  250
26.2.4  琼脂糖凝胶电泳和胶回收  250
26.2.5  DNA克隆  250
26.2.6  RNA转录与加帽  251
26.2.7  克隆衍生CHIKV复制与扩增  251
26.2.8  定点突变  251
26.3  方法  252
26.3.1  病毒RNA提取与cDNA合成  252
26.3.2  PCR扩增病毒cDNA片段  252
26.3.3  将病毒cDNA克隆至质粒载体  253
26.3.4  CHIKV RNA转录本合成  255
26.3.5  通过RNA转染获得感染性克隆来源的CHIKV  255
26.3.6  克隆来源的CHIKV扩增与特性研究  256
26.3.7  通过定点突变技术将突变引入全长cDNA克隆  256
26.4  注释  257
参考文献  258
第二十七章  在昆虫细胞中制备基孔肯雅病毒样颗粒和亚单位疫苗  260
27.1  引言  260
27.2  材料  261
27.2.1  细胞培养  261
27.2.2  重组杆状病毒Ac-sE1、Ac-sE2和Ac-S27制备  261
27.2.3  CHIKV-sE1和-sE2糖蛋白亚单位及VLP制备  263
27.2.4  CHIKV-sE1和-sE2糖蛋白亚单位纯化  263
27.2.5  CHIKV-VLP纯化  263
27.2.6  CHIKV糖蛋白分析  263
27.3  方法  264
27.3.1  细胞培养  264
27.3.2  重组杆状病毒Ac-sE1、Ac-sE2和Ac-S27制备  264
27.3.3  CHIKV-sE1和-sE2亚单位及VLP制备  267
27.3.4  sE1和sE2亚单位纯化  267
27.3.5  CHIKV-VLP纯化  268
27.3.6  CHIKV蛋白分析  268
27.4  注释  269
参考文献  271
第二十八章  基孔肯雅病毒DNA新型疫苗的研发程序  273
28.1  引言  273
28.2  材料  276
28.2.1  体外转染  276
28.2.2  SDS-PAGE和Western blotting  277
28.2.3  免疫荧光分析  277
28.2.4  DNA疫苗免疫小鼠  278
28.2.5  免疫小鼠脾细胞分离  278
28.2.6  IFN-γ酶联免疫斑点试验  278
28.2.7  酶联免疫吸附试验（ELISA）  279
28.2.8  流式细胞术和细胞内细胞因子染色试验  279
28.2.9  病毒中和试验  280
28.2.10  猕猴DNA质粒免疫研究  280
28.3  方法  280
28.3  DNA疫苗设计  280
28.3  体外转染  281
28.3  SDS-PAGE和  Western blotting  282
28.3  免疫荧光分析（IFA）  282
28.3  DNA疫苗免疫小鼠  283
28.3  免疫小鼠脾细胞分离  283
28.3  IFN-γ酶联免疫斑点试验  284
28.3  ELISA结合实验  284
28.3  流式细胞术（FACS）和细胞内细胞因子染色（ICS）分析  285
28.3  病毒中和试验  286
28.3  恒河猴DNA质粒免疫研究  286
28.4  注释  287
参考文献  289