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正版新书]生物化学实验教程郏弋萍9787030419828
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目 录 部 验实验 实验一 蛋白质两游离和等电点测定 (1) 实验二 影响酶促反应因素 (6) 实验三 琥珀酸脱氢酶活测定 (12) 实验四 酮体生成和利用 (16) 实验五 转氨基作用 (20) 第二部分 综合实验 实验六 基本操作 (24) 实验七 分光光度计 (722型)基本操作(30) 实验八 血糖测定 (35) 实验九 RNA提取与鉴定 (39) 实验十 肾功能项目 (肌酐与尿素氮测定)(43) 实验十一 肝功能丙氨酸氨基转移酶 (ALT)测定(47) 第三部分 临床相关实用化检测项目 实验十二 总胆固醇 (TC)测定(53) 实验十三 血清 (浆)总蛋白(TP)测定(58) 实验十四 血清甘油三酯 (TG)测定(63) 实验十五 血钙与血磷测定 (67)
部 验实验 实验一 蛋白质两游离和等电点测定 一、实验目的 1.验蛋白质的两电离和等电点。 2.掌握测定酪蛋白等电点的原理和方法。 二、实验原理 (一)相关理论知识 蛋白质分子中既含有酸基团,又含有碱基团,是两化合物。这些基团在不同的pH值溶液中可发生酸式电离或碱式电离。蛋白质在水溶液中的带电情况,不仅取决于本身的结构,还取决于溶液的pH值。调节溶液的pH值,可使蛋白质带有不同的电荷。当蛋白质溶液的pH>pI时,蛋白质分子带负电;当蛋白质溶液的pH<pI时,蛋白质分子带正电;当蛋白质溶液的pH=pI时,蛋白质分子不显电(此时蛋白质分子为兼离子或两离子)(图1-1)。蛋白质分子处于兼离子状态时的溶液pH值称为该蛋白质的等电点 阳离子 两离子 阴离子 pH<pI pH<pI pH<pI 图 1-1 蛋白质两解离与等电点 人体中大多数蛋白质的等电点在5.0左右,所以在组织和体液pH7.4环境中,这些蛋白质解离成阴离子。 (二)原理 不同的蛋白质分子有不同的等电点。在pI时,蛋白质分子所带正负电荷相等,净电荷为零,其溶解度低,易沉淀析出。偏离其pI时,蛋白质分子带有同种电荷,互相排斥,不易发生沉淀,在一定pH值范围内,偏离其pI越远,蛋白质分子带有同种电荷越多,越不易发生沉淀。因此,可根据蛋白质分子在溶液中的沉淀析出情况,来测定蛋白质的等电点(图1-2)。 图 1-2 蛋白质胶体沉淀 三、实验内容 (一)蛋白质两解离质验 1.取试管1支,向试管中加入1.0ml酪蛋白溶液。 2.按表1-1操作,并解释。 表 1-1 蛋白质两解离验分析 加人物(滴) 溶液颜色变化 沉淀情况变化 解释现象 溴甲酿绿指示剂5 ~7滴 逐滴加人0. 02mol/L盐酸溶液 继续逐滴加人0. 02mol/L盐酸溶液 逐滴加人0. 02mol/L氢氧化钠溶液 继续逐滴加人0. 02mol/L氢氧化钠溶液 表 1-2 酪蛋白等电点测定 管号 试剂 1 4 5 蒸馏水(ml) 1.6 —— 3.0 1.5 3. 38 0. 01mol/L 乙酸(ml) —— —— —— 2.5 0.62 0. lmol/L 乙酸(ml) —— 4.0 1.0 —— —— 1. Omol/L 乙酸(ml) 2.4 —— —— —— —— 5g/L酪蛋白乙酸钠溶液(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 溶液pH值 3.2 4.1 4.7 5.3 5.9 沉淀结果 2.立即混匀各管,静置10分钟,观察各管沉淀情况,结果用“-,+,++,+++”表示,并记录于表1-2中。 3.根据实验结果选出酪蛋白的等电点。 四、实验注意事项 1.正确使用移液管和胶头滴管,保取样准确。 2.两解离验实验中酸碱滴定手法:逐滴加入,边加边摇,不可操之过急。 五、实验仪器和主要试剂 (一)试剂 乙酸 0.01mol/L 乙酸0.1mol/L 乙酸1.0mol/L 酪蛋白5g/L乙酸钠溶液(称取纯酪蛋白0.25克,加放蒸馏水20ml及1.0mol/L氢氧化钠5毫升,混合至酪蛋白完全溶解,然后加入1.0mol/L乙酸5ml,移入50ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度)。 溴甲酚绿指示剂 盐酸溶液0.02mol/L 氢氧化钠溶液0.02mol/L (二)仪器 移液管、胶头滴管、洗耳球等。 六、思考讨论 1.为什么蛋白质溶液在等电点时刻具有多沉淀? 2.为什么加酸多了沉淀会消失?同理加碱多了沉淀为什么也会消失? 七、结果记录与分析 1.结果记录。 酪蛋白等电点是 。 2.分析。 (郏戈萍) 实验二 影响酶促反应因素 一、实验目的 1.通过本实验,观察诸因素对酶促反应速度的影响。 2.理解温度与pH值。 二、实验原理 (一)相关理论知识 酶是由活细胞分泌的具有催化活的蛋白质,其催化的反应称为酶促反应。由于其本质为蛋白质,所以酶促反应具有高度催化效率、高度特异、度不稳定和活可调节的特点。还是因为酶是蛋白质,受理化因素影响会发生变失活,所以酶促反应速度就会发生改变。影响酶促反应因素主要有酶浓度、底物浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂(图2-1)。本实验主要讨论温度、pH值、抑制剂和激活剂影响。底物与酶浓度在整个实验中不变。 (二)原理 唾液淀粉酶对淀粉的水解过程是“淀粉糊精麦芽糖”,淀粉和糊精遇碘溶液可产生颜色有蓝色、紫红色、褐色和红色,而麦芽糖遇 碘不显色,只显示碘液的黄色。因此根据不同的颜色,就可了解淀粉水解的程度(图2-2)。 由于在不同温度或酸碱度下,酶活低不同,所以在同一时间内淀粉被水解的程度也不一样。还有淀粉酶遇激活剂或抑制剂时,酶活也不同,以致影响了淀粉被水解的程度。因此,通过与碘产生不同的颜色,可以了解温度、pH、激活剂与抑制剂对酶促反应的影响。
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