家蚕微粒子病防控技术 鲁兴萌 著 专业科技 文轩网

前言
绪论 1
第一篇 家蚕微粒子虫来源及防控技术
第1章 感染家蚕的微孢子虫 11
1.1 家蚕微粒子虫 11
1.1.1 家蚕微粒子虫的分类简史 11
1.1.2 家蚕微粒子虫的分类学地位 12
1.1.3 家蚕微粒子虫的分类学特征 12
1.2 其他家蚕微孢子虫 14
1.2.1 具褶孢虫属（Pleistophora）的分类学特征和地位 15
1.2.2 泰罗汉孢虫属（Thelohania）的分类学特征和地位 16
1.2.3 变形孢虫属（Vairimorpha）的分类学特征和地位 17
1.2.4 内网虫属（Endoreticulatus）的分类学特征和地位 19
1.3 养蚕相关昆虫来源微孢子虫 20
1.3.1 野外昆虫来源微孢子虫 20
1.3.2 野外昆虫来源微孢子虫的分类学研究 21
1.3.3 野外昆虫来源微孢子虫对家蚕的感染性 21
1.4 家蚕微粒子虫的生物进化分析 22
1.4.1 基于分子生物学的分类与进化分析 22
1.4.2 家蚕微粒子虫α-和β-微管蛋白部分基因的克隆及系统发育分析 25
1.5 家蚕来源内网虫属样微孢子虫 32
1.5.1 内网虫属样微孢子虫的形态学和感染性观察 33
1.5.2 内网虫属样微孢子虫嵊州株rRNA基因序列的研究 36
第2章 家蚕微孢子虫的变异 42
2.1 昆虫微孢子虫的寄主域 42
2.1.1 微孢子虫的寄主专一性 42
2.1.2 温度和光照等环境因子对微孢子虫感染性的影响 44
2.1.3 家蚕微粒子虫对其他昆虫的感染性及感染后的孢子形态变化 45
2.2 家蚕微粒子虫感染桑尺蠖后孢子表面蛋白的变化 50
2.2.1 家蚕微粒子虫与24Nb-H孢子表面蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）比较 51
2.2.2 家蚕微粒子虫与24Nb-H孢子表面蛋白的2-DE比较 51
2.2.3 家蚕微粒子虫与24Nb-H孢子总蛋白的SDS-PAGE比较 53
2.2.4 家蚕微粒子虫与24Nb-H孢子总蛋白的固相2-DE比较 54
2.2.5 孢子表面蛋白与总蛋白的2-DE图谱比较 56
2.3 家蚕来源内网虫属样微孢子虫嵊州株与Nb孢子表面蛋白的比较 58
2.3.1 内网虫属样微孢子虫嵊州株与Nb孢子表面蛋白的SDS-UreaPAGE比较 59
2.3.2 内网虫属样微孢子虫嵊州株与Nb孢子表面蛋白的固相2-DE比较 59
第3章 养蚕环境中微孢子虫的分布与家蚕微粒子病检测技术 65
3.1 养蚕环境病原微生物的分布 65
3.1.1 取样和检测方法 67
3.1.2 蚕室环境样本的检测 68
3.1.3 不同养蚕技术水平农户不同蚕室环境样本的检出率比较 70
3.1.4 不同养蚕阶段蚕室环境样本的检出率比较 71
3.2 家蚕微粒子病的免疫学检测技术 73
3.2.1 免疫学检测技术的特点 74
3.2.2 液氮处理Nb孢子和未处理Nb孢子包被效果的对比 75
3.2.3 纯化Nb孢子的ELISA检测及模拟感染家蚕微粒子病蚕卵的检测 75
3.3 家蚕微粒子病的分子生物学检测技术 79
3.3.1 家蚕微粒子虫孢子的破碎与核酸获取 79
3.3.2 常规PCR检测 87
3.3.3 荧光定量PCR检测 92
3.3.4 蚕种（卵）的家蚕微粒子病检测 96
3.3.5 蚕卵组织对荧光定量PCR检测的影响 102
第二篇 家蚕微粒子虫在个体中扩散及防控技术
第4章 家蚕微粒子虫孢子发芽和入侵细胞 111
4.1 家蚕微粒子虫孢子的发芽 111
4.1.1 家蚕微粒子虫孢子的发芽过程 111
4.1.2 微孢子虫孢子发芽前-后孢内糖的变化 112
4.1.3 环境理化因子对微孢子虫孢子发芽的影响 113
4.2 家蚕微粒子虫孢子发芽相关孢壁蛋白的研究 115
4.2.1 家蚕微粒子虫孢子孢壁蛋白单克隆抗体特异性鉴定 116
4.2.2 单克隆抗体对家蚕微粒子虫孢子体外发芽的影响 117
4.2.3 单抗3C2对家蚕微粒子虫孢子感染BmN细胞的影响 118
4.2.4 家蚕微粒子虫孢子表面蛋白SP84的分离纯化及定位 122
4.2.5 家蚕微粒子虫孢子表面蛋白SP84的免疫共沉淀和质谱鉴定 125
4.3 家蚕微粒子虫孢子发芽前-后转录组的差异分析 130
4.3.1 转录组序列拼接和分析 130
4.3.2 基因注释和差异基因表达分析 131
4.3.3 差异表达基因聚类分析和功能富集性分析 135
4.3.4 家蚕微粒子虫孢子发芽相关候选基因的预测 137
4.4 家蚕微粒子虫孢子发芽前-后的Label-free蛋白质组学定量分析 139
4.4.1 家蚕微粒子虫孢子发芽前-后蛋白质的Label-free定量色谱分析 139
4.4.2 家蚕微粒子虫孢子发芽前-后鉴定蛋白的GO分析 145
4.4.3 家蚕微粒子虫孢子发芽前-后鉴定蛋白的KEGG分析 148
第5章 家蚕微粒子虫入侵家蚕细胞及繁殖 155
5.1 家蚕微粒子虫与粉纹夜蛾培养细胞的相互作用 156
5.1.1 家蚕微粒子虫孢子接种Tn培养细胞的透射电镜观察 156
5.1.2 家蚕微粒子虫孢子接种Tn培养细胞的激光共聚焦显微镜观察 157
5.1.3 家蚕微粒子虫孢子接种Tn培养细胞的孢子计数和大小测定 159
5.1.4 Tn培养细胞总蛋白和Nb孢壁蛋白的SDS-PAGE分析 160
5.2 家蚕微粒子虫感染家蚕幼虫对部分生理生化指标的影响 162
5.2.1 家蚕微粒子虫感染家蚕幼虫对生长发育、中肠和血液蛋白酶活性的影响 163
5.2.2 家蚕微粒子虫感染家蚕幼虫对血液和中肠蛋白的影响 166
5.2.3 家蚕微粒子虫感染家蚕幼虫对海藻糖酶活性的影响 167
5.3 家蚕微粒子虫孢子母细胞和成熟孢子蛋白差异的比较 168
5.3.1 家蚕微粒子虫孢子生殖阶段细胞的分离 169
5.3.2 孢子母细胞和成熟孢子蛋白的2-DE分析 171
5.3.3 MALDI-TOF/TOFMS分析及数据库搜索 171
5.4 家蚕微粒子虫感染家蚕培养细胞的蛋白质组分析 173
5.4.1 家蚕微粒子虫在BmN培养细胞中的增殖 173
5.4.2 接种Nb孢子BmN细胞培养物的2-DE分析 173
5.4.3 接种Nb孢子BmN细胞培养物差异蛋白点的质谱鉴定 175
5.4.4 接种Nb孢子细胞培养物差异蛋白的生物信息学分析与功能验证 176
5.5 家蚕微粒子虫对寄主BmN细胞凋亡的抑制作用 186
5.5.1 微粒子虫感染与家蚕细胞凋亡 187
5.5.2 放线菌素D处理BmN培养细胞的DNA片段化 190
第6章 家蚕微粒子虫感染家蚕相关基因及功能 198
6.1 家蚕微粒子虫孢子SWP5蛋白基因及功能 198
6.1.1 家蚕微粒子虫孢子蛋白基因的克隆、表达及定位 198
6.1.2 家蚕微粒子虫孢子NbSWP5蛋白在感染过程中的作用 202
6.2 家蚕微粒子虫孢壁蛋白SWP12基因的克隆、表达分析及功能研究 209
6.2.1 家蚕微粒子虫孢子HSWP12蛋白基因的克隆和抗体制备 210
6.2.2 家蚕微粒子虫孢子孢壁蛋白SWP12在细胞中的表达与定位 213
6.2.3 多克隆抗体对家蚕微粒子虫孢子黏附及感染的抑制效果 214
6.3 家蚕微粒子虫蓖麻毒素B凝集素在感染过程中的功能 215
6.3.1 家蚕微粒子虫蓖麻毒素B凝集素基因的序列分析、表达差异分析和克隆 216
6.3.2 家蚕微粒子虫蓖麻毒素B凝集素对Nb孢子黏附BmN细胞的影响 220
6.3.3 家蚕微粒子虫蓖麻毒素B凝集素对Nb侵染BmN细胞的影响 221
6.4 家蚕微粒子虫Akirin蛋白基因的鉴定与序列分析 223
6.4.1 家蚕微粒子虫感染BmN细胞的基因差异表达 226
6.4.2 家蚕微粒子虫Akirin蛋白基因的克隆和测序分析 231
第7章 家蚕消化道的细菌微生态 237
7.1 基于16SrDNA测序的家蚕消化道细菌微生态 238
7.1.1 小蚕期家蚕消化道细菌微生态 238
7.1.2 5龄期家蚕消化道细菌微生态 241
7.1.3 家蚕消化道细菌微生态的主要特征 248
7.2 健康家蚕消化道肠球菌及多样性 255
7.2.1 肠球菌分离菌株表型特征的多样性 256
7.2.2 肠球菌的数值鉴定和多样性分析 260
7.2.3 基于RAPD技术的家蚕肠球菌多样性 263
7.2.4 基于染色体杂交技术的家蚕肠球菌菌种鉴定 264
7.2.5 基于16SrDNA测序的家蚕肠球菌菌种鉴定 268
7.2.6 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定技术 271
7.3 家蚕消化液抗肠球菌蛋白 272
7.3.1 家蚕5龄幼虫消化液抗肠球菌蛋白的分离纯化与抑菌活性检测 272
7.3.2 不同家蚕品种的抗肠球菌蛋白 274
7.3.3 抗肠球菌蛋白的部分特征 275
7.4 家蚕微粒子虫感染对家蚕中肠肠球菌结构的影响 276
7.4.1 肠球菌总数的变化及主要菌属 277
7.4.2 家蚕微粒子虫感染对肠球菌分布的影响 280
第8章 家蚕个体水平防控技术的研究 284
8.1 基于物理因子的蚕种高温浸酸和热空气处理 284
8.2 基于化学因子的家蚕微粒子病防控药物实验 285
8.2.1 几种化学药物对家蚕微粒子病的浓度效应 286
8.2.2 化学药物不同添食方式的治疗效果 287
8.2.3 化学药物对不同剂量微粒子虫孢子感染的治疗效果 288
8.3 微生物因子对家蚕微粒子病发生的影响 289
8.3.1 家蚕消化道来源肠球菌对家蚕微粒子虫孢子发芽的抑制作用 289
8.3.2 肠球菌体外抑制家蚕微粒子虫孢子发芽的动力学研究 292
8.3.3 肠球菌培养物的活性物纯化与活性测定 296
第三篇 家蚕微粒子虫在饲养群体中扩散及防控技术
第9章 环境来源家蚕微粒子虫的传播规律及防控技术 307
9.1 家蚕微粒子病的流行规律分析 310
9.1.1 蚕种生产量对家蚕微粒子病发生的影响 312
9.1.2 前-后季养蚕对家蚕微粒子病发生的影响 313
9.1.3 不同生产季节对家蚕微粒子病发生的影响 314
9.1.4 不同生产方式对家蚕微粒子病发生的影响 315
9.1.5 其他客观因素对家蚕微粒子病发生的影响 316
9.2 消毒和生产过程家蚕微粒子病检测等技术措施对其发生的影响 317
9.2.1 家蚕微粒子虫对物理和化学因子的抵抗性 318
9.2.2 化学药物对家蚕微粒子虫的杀灭作用 318
9.2.3 预知检查和补正检查 324
9.3 母蛾检测批的规模类型对家蚕微粒子病流行的影响 328
9.3.1 不同母蛾检测批的规模类型数据样本与数据处理 329
9.3.2 母蛾检测批的规模类型变化 329
9.3.3 母蛾检测中未检出和检出合格蚕种的分布规律 332
9.3.4 母蛾检测中淘汰蚕种的分布规律 334
第10章 家蚕微粒子虫胚胎感染的传播规律及防控技术 338
10.1 家蚕幼虫期感染与母蛾感染率、感染程度及胚胎感染率的关系 339
10.1.1 家蚕5龄幼虫后期不同浓度家蚕微粒子虫添食感染的母蛾感染率及感染程度 339
10.1.2 家蚕5龄期不同阶段经不同剂量家蚕微粒子虫口腔注射感染的母蛾感染率 340
10.1.3 感染母蛾的胚胎感染率 343
10.2 原种母蛾检测与一代杂交蚕种农村饲养家蚕微粒子病传染扩散 346
10.2.1 不同家蚕品种的原种母蛾检测 347
10.2.2 不同母蛾检测结果类型一代杂交蚕种的农村饲养 350
10.3 家蚕微粒子虫胚胎感染的传播规律 358
10.3.1 家蚕饲养及胚胎感染母蛾个体样本制作和检测 360
10.3.2 不同家蚕微粒子虫感染程度母蛾所产蚕卵的混育实验 361
10.3.3 个体育实验家蚕微粒子病的检出时相 365
10.4 成品卵的家蚕微粒子病检测 368
10.4.1 成品卵均匀性的调查和评价 369
10.4.2 散卵种的集团催青和样本制作方法 382
第11章 家蚕微粒子病的风险管理 386
11.1 家蚕微粒子病防控技术体系的基本结构 386
11.1.1 空间维度上的防控结构 387
11.1.2 时间维度上的防控结构 388
11.1.3 抗性维度上的防控结构 389
11.1.4 家蚕微粒子病防控与风险管理 389
11.2 蚕种微粒子病检测的风险评估 391
11.2.1 一代杂交蚕种家蚕微粒子病检测及判断标准的变迁 392
11.2.2 蚕种家蚕微粒子病检测的风险阈值 393
11.2.3 基于生物学实验的风险阈值研究 394
11.3 家蚕微粒子病防控风险管理的技术体系 404
11.3.1 风险控制强度与社会经济地位的关系 404
11.3.2 家蚕微粒子病防控的技术管理体系 406
11.3.3 家蚕微粒子病防控中检测技术管理体系的重构 408
第四篇 实验方法
第12章 微孢子虫相关的生物类实验 415
12.1 家蚕微粒子虫的繁殖、纯化与保存 415
12.1.1 家蚕微粒子虫的繁殖 415
12.1.2 家蚕微粒子虫孢子的纯化 417
12.1.3 家蚕微粒子虫的保存 421
12.1.4 桑尺蠖和斜纹夜蛾饲养与微孢子虫感染繁殖 421
12.2 家蚕微粒子虫孢子的体外发芽实验 423
12.2.1 家蚕微粒子虫孢子的准备 423
12.2.2 孢子发芽率测定的实验流程 423
12.2.3 孢子发芽率的测定 423
12.3 家蚕微粒子虫生殖阶段细胞的分离与电镜观察 424
12.4 家蚕细胞培养和感染相关实验 425
12.4.1 家蚕微粒子虫感染BmN细胞 425
12.4.2 家蚕BmN细胞凋亡实验 425
第13章 微孢子虫相关的蛋白质和核酸类相关的实验 427
13.1 酶活性和蛋白质含量测定 427
13.1.1 谷胱甘肽-S-转移酶活性的分光光度计法测定 427
13.1.2 家蚕中肠和血液中蛋白酶的测定 427
13.1.3 样品蛋白质浓度测定方法 428
13.2 蛋白质分离与纯化 429
13.2.1 家蚕中肠组织蛋白的提取 429
13.2.2 家蚕微粒子虫孢子蛋白的纯化 430
13.2.3 家蚕微粒子虫孢子总蛋白的SDS-PAGE分析 432
13.2.4 家蚕微粒子虫孢子表面蛋白的SDS-PAGE和SDS-UreaPAGE分析 434
13.2.5 家蚕微粒子虫NGS组和GS组总蛋白的SDS-PAGE分析 434
13.2.6 家蚕微粒子虫孢子总蛋白的固相2-DE分析 435
13.2.7 蛋白质谱的分析 437
13.2.8 家蚕微粒子虫孢子总蛋白的FASP法酶解处理 440
13.3 抗体制备及检测相关实验 440
13.3.1 家蚕微粒子虫孢子外孢壁蛋白单克隆抗体的制备 440
13.3.2 单抗3C2预处理后的Nb孢子对BmN细胞的接种及共培养 444
13.3.3 单抗的胶体金定位 444
13.3.4 单抗3C2的免疫共沉淀（Co-IP） 445
13.3.5 多克隆抗体的制备和效价测定 447
13.3.6 Westernblotting实验 448
13.3.7 间接荧光抗体技术（IFAT） 449
13.3.8 DAPI活体荧光染色观察 449
13.3.9 孢子黏附及感染实验 449
13.4 家蚕微粒子虫核酸提取及分析 450
13.4.1 家蚕微粒子虫基因组DNA的抽提 450
13.4.2 家蚕微粒子虫孢子总RNA的提取 450
13.4.3 家蚕微粒子虫微管蛋白基因的PCR扩增与测序 451
13.4.4 家蚕微粒子虫孢子发芽前-后转录组的分析方法 452
13.4.5 家蚕微粒子虫NbRBL基因在不同发育阶段的表达差异 453
13.4.6 内网虫属样微孢子虫嵊州株rRNA全基因的克隆测序与分析 457
13.5 肠球菌核酸相关实验 460
13.5.1 肠球菌DNA的提取 460
13.5.2 肠球菌16SrDNA的序列分析 461
参考文献 462
附录一 家蚕微粒子病和微粒子虫生活史 488
附录二 学名及分类单位用语对照 491
附录三 相关缩写和简称 496
附录四 相关研究受资助科技项目清单 502
跋 504